Klon 3

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title: Klon 3 updated: 2023-10-03T15:05:18 created: 2023-09-21T11:55:42

Pcr

• 25 ul
• 12,5 Ul Q5 MM
• Primer 1,25 ul 10 uM
  • HH R 3
  • T7
• DNA 5 ng
• H2O

Cycler setting

1. Denaturation - 98 °C - 30 s 38 cycles:
2. Denaturation - 98 °C - 10 s
3. Anneling - 60 °C - 30 s
4. Elongation - 72 °C - 1 min
5. Final extension - 72 °C - 2 min

1.5 % gel 85 V h

Restriction

• EcoRI FD - 0,5 ul

• XbaI x2 = 1 ul

• PCR produkt

  • 10 ul

• Buffer rCutSmart 10x - 1,5 ul

• H2O - 2 ul

• EcoRI - 1 ul

• XbaI - 2 ul

• BB

  • S9A - 360 ng/ul
    • 5,6 ul

• Fosf - 1 ul

• Buffer - 1,5 ul

• H2O - to 15

Ligation

• DNA - 66 ng INS + 90 ng VeC
  • BB - 1,3 ul done
  • S9A - 5 uldone
  • K85 - 9,3 ul Doine
• Buffer 10X 1.5 ul
• Ligase 1 ul
• H2O s9 - 6,2
• K85 - 1,9

RT 1h Transform

9

SCREENING

• 15 ul reakce
• DreamTaq MM 2X - 7,5 ul
• DNA = bacteria - 5 ul
• Primer - F,R (10 uM) - 0,5 uM - 0,75 ul
• H2O - 1 ul

PCR Setting

SCREENING 2

• Temperature 62
• MINIPrep first?

15 ul r MM - 7,5 ul DNA = prep - 0,8 ul H2O 5,2 ul